...

Protoplas - Retno Mastuti

by user

on
Category: Documents
2

views

Report

Comments

Transcript

Protoplas - Retno Mastuti
Kultur jaringan Tumbuhan - Semester Genap 2002-2003
TOPIK XI. PROTOPLAS
Cobalah pahami isi kuliah dengan topik protoplas dengan
mempelajari pertanyaan-pertanyaan yang diberikan.
ISOLASI PROTOPLAS
Dinding sel tanaman berfungsi sebagai penunjang mekanik,
pelindung dari kerusakan fisik maupun serangan patogen, dll. Pada
tahun 1960 EC Cocking menemukan enzim pendegradasi selulosa
sbg. Salah satu komponen dinding sel sehingga diperoleh protoplas.
Selanjutnya dengan nutrisi yang sesuai protoplas yang dikultur
ternyata mempunyai kemampuan membelah. Selanjutnya pada
tahun 1971 protoplas telah berhasil diupayakan untuk mengalami
regenerasi planlet. Dari hasil penelitian tersebut maka protoplas
mulai digunakan sebagai dasar kajian bioteknologi.
Pertanyaan : Pengaruh keberadaan dinding sel dapat sebagai
a)……… b)……dan c)…….. Bagaimana sejarah perkembangan
protoplas ? Yang pertama kali menggunakan enzim untuk isolasi
protoplas adalah………
Protoplas adalah bagian sel tanaman yang telah
dihilangkan dinding selnya baik dengan metode mekanik maupun
enzimatik. Tanpa adanya dinding sel sebagai pelindung maka
protoplas menjadi sangat fragil terhadap perubahan tekanan osmotik
maupun stres mekanik yang lain. Bila protoplas dibebaskan pada
lingkungan air dengan osmolaritas rendah protoplas akan pecah
karena air banyak masuk ke dalam protoplas. Adanya dinding sel
menahan ekspansi protoplas sehingga menimbulkan tekanan turgor.
Untuk isolasi protoplas diperlukan cairan dengan osmolaritas sedikit
lebih tinggi sehingga dengan adanya pergerakan cairan keluar
menyebabkan protoplas sedikit mengkerut, volumenya menurun dan
plasmalema terpisah dari dinding sel. Selama proses berikutnya
harus dapat mencapai mencapai keseimbangan dimana tekanan
osmotik di luar sama dengan di dalam sehingga membentuk
protoplas yang sferis.
Pertanyaan : Apa yang dimaksud protoplas ? Bagaimana protoplas
bisa dihasilkan ? bagaimana tekanan osmotik yang dibutuhkan ?
Bagaimana bisa diperoleh bentuk protoplas yang sferikal ?
Pada prinsipnya isolasi protoplas baik secara mekanik maupun
enzimatik didahului dengan proses plasmolisis. Prinsip metode
mekanik adalah adanya pemotongan bagian dinding sel setelah sel
mengalami plasmolisis yang tujuannya adalah untuk memberi jalan
bagi ‘keluarnya’ protoplas. Dengan adanya tekanan turgor dari
vakuola sel selanjutnya protoplas akan terdorong ‘keluar’. Oleh
karena itu metode ini sesuai untuk sel-sel dewasa. Keuntungan nya
adalah tidak adanya resiko toksik yang disebabkan oleh senyawa
kimia. Tetapi metode ini menghasilkan protoplas dalam jumlah
sedikit. Isolasi secara enzimatik menggunakan enzim pendegradasi
komponen dinding sel. Metode ini dapat menghasilkan sub protoplas,
proses plasmolisis konveks maupun konkaf. Walaupun ada
pengaruh toksik dari bahan kimia tsb. metode enzimatik yang sesuai
untuk sel meristematik ini menghasilkan protoplas dalam jumlah
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
Kultur jaringan Tumbuhan - Semester Genap 2002-2003
yang jauh lebih banyak dibanding metode mekanik. Kelompok enzim
yang umum digunakan adalah selulase yang dihasilkan oleh
Trichoderma viride, Aspergillus niger maupun Irpex lateus,
hemiselulase yang dihasilkan oleh A. niger serta pektinase yang
dihasilkan oleh baik A. niger maupun A. japonicus. Dengan enzim
isolasi protoplas bisa dilakukan dalam satu atau dua tahap.
Pertanyaan : Metode isolasi protoplas secara umum ada 2 yaitu …..
dan …….. yang pada dasarnya harus melalui proses plasmolisis
terlebih dahulu. Bagaimana prinsip metode secara mekanik ?
Metode ini sesuai untuk jenis sel yang bagaimana ? Apa kelemahan
dan keuntungan metode ini ? Dengan metode isolasi protoplas
secara enzimatik bisa didapatkan jenis-jenis plasmolisis, yaitu …….
dan …… Metode ini sesuai untuk jenis sel yang bagaimana ? Apa
kelemahan dan keuntungan metode ini ? Enzim untuk isolasi dapat
dikelompokkan menjadi 3 berdasar ……, yaitu ……, ………, dan
……………..
Beberapa faktor yang mempengaruhi kualitas dan kuantitas
protoplas adalah senyawa enzim, kondisi osmotik, jaringan sel
donor, komponen lain dalam larutan isolasi serta metode inkubasi
selama isolasi. Selain mempertimbangkan komponen dinding sel
perlu diingat bahwa untuk setiap spesies dengan kondisi
pertumbuhan yang berbeda akan mempunyai variasi terhadap
kebutuhan jumlah komponen maupun jumlah tiap komponen enzim.
Pengaturan osmotikum dilakukan dengan penambahan gula atau
gula alkohol yang bersifat inert. Yang paling umum adalah manitol
dan sorbitol dengan konsentrasi 0.3-0.7 M. Ketepatan tekanan
osmotik bisa menyebabkan perolehan protoplas berbentuk sferis
dengan viabilitas tinggi. Mengapa ? Ketidak sesuaian tekanan
osmotik dapat menyebabkan stres yang berpengaruh pada
menurunnya kondensasi DNA maupun sintesis protein yang akan
mengakibatkan aktivitas metabolik dan pertumbuhan menurun.
Kondisi jaringan atau sel donor yang mempunyai kondisi
pertumbuhan dan fisiolgis yang baik dapat diupayakan dengan
perlakuan pendahuluan yaitu : subkultur teratur, peningkatan
konsentrasi auksin, penurunan konsentrasi karbohidrat serta
inkubasi pada kondisi gelap. Kondisi selama inkubasi dalam latutan
enzim juga perlu diperhatikan, yang berkaitan dengan temperatur,
durasi inkubasi, intensitas cahaya, pH dan tanpa/dengan
penggojogan. Kualitas protoplas yang dapat dilihat dengan uji
viabilitas dapat dilakukan dengan berbagai cara, yaitu adanya
siklosis, aktivitas fotosintesis atau yang paling umum adalah dengan
pewarnaan. Zat warna ini mempunyai sifat yang berbeda dalam
menunjukkan viabilitas protoplas. Kemampuan menyerap zat warna
menunjukkan viabilitas, sebaliknya kemampuan menyerap zat warna
menunjukkan kondisi tidak viabel. Hal ini berkaitan dengan kondisi
membran protoplas. Selain itu pewarna yang dapat mengindikasikan
adanya regenerasi dinding sel juga dapat digunakan untukmelihat
viabilitas protoplas.
Pertanyaan : Beberapa faktor yang mempengaruhi kuantitas maupun
kualitas protoplas adalah senyawa enzim. Ini sangat dipengaruhi
oleh species tanaman, kondisi pertumbuhannya serta komponen
dinding selnya. Apa maksudnya ? Pada metode enzimatik apa yang
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
Kultur jaringan Tumbuhan - Semester Genap 2002-2003
dimaksud dengan metode satu dan dua tahap ? Kadang perlu
dilakukan perlakuan preenzimatik untuk mempercepat degradasi
dinding sel.
Pengaruh lain adalah kondisi osmotis. Apa yang biasa
digunakan ? berapa konsentrasinya ? Apa yang bisa dipengaruhi
akibat stres osmotik ? Selain itu tetap perlu diperhatikan kondisi sel
donor atau tanaman dalam hal pertumbuhan maupun fisiologisnya.
Beberapa hal bisa dilakukan untuk ‘mempersiapkan’ kondisi tsb.
Yaitu ………..
Apa saja komponen-komponen lain yang sering ditambahkan
pada larutan isolasi, apa fungsi/peran masing-masing komponen itu
? Kualitas dan kuantitas juga dipengaruhi oleh metode inkubasi yang
perlu memperhatikan beberapa hal yaitu ……………….
Uji viabilitas perlu dilakukan untuk mengetahui kualitas protoplas
yang dihasilkan. Beberapa hal yang bisa digunakan sebagai indikator
adalah…….. Bagaimana indikasi viabilitas masing-masing masingmasing pewarna tersebut ?
Protoplas yang utuh dan viabel harus dipisahkan dari protoplas
non viabel, debris dan larutan enzim. Karena selama proses
degradasi dinidng sel dapat ‘dibebaskan’ enzim hidrolitik maupun
senyawa fenolik yang dapat mengganggu proses metabolisme. Oleh
karena itu perlu dilakukan pemurnian atau purifikasi. Yaitu dengan
mengkombinasikan perlakuan sentrifugasi dengan kecepatan yang
sesuai, filtrasi, pengapungan dengan sukrosa 21% serta pencucian.
Bila waktu isolasi telah dianggap menghasilkan protoplas dalam
jumlah mencukupi maka larutan enzim yang mengandung protoplas
disaring dengan nylon mesh untuk memisahkan debris kasar.
Selanjutnya larutan protoplas dalam enzim disentrifugasi.
Supernatan yang berupa larutan enzim (berwarna coklat) diambil
secara perlahan dengan menggunakan pipet sampai tinggal pelet
berupa protoplas dan debris halus. Kemudian dilakukan pencucian
dengan larutan pencuci (komposisi sama dengan larutan enzim,
tetapi tanpa enzim) beberapa kali sampai warna coklat tidak tampak
(dianggap larutan enzim sudah tercuci semua) maka dilanjutkan
dengan pengapungan. Supernatan diambil dan disisakan seminimal
mungkin. Pada tabung reaksi yang lain kira 1/3 volume telah diisi
terlebih dahulu dengan sukrosas 21%. Setelah pelet protoplas
dihomogenkan (gerakan pompa-hisap pada pipet secara perlahan)
kemudian ditambahkan ke atas larutan sukrosa 21% secara
perlahan, dan disentrifugasi. Selanjutnya akan terlihat ada tiga lapis
cairan, yaitu : bagian bawah cairan sukrosa 21% dengan pelet yang
berisi debris maupun protoplas non viabel, bagian atas adalah cairan
pencuci yang jernih dan yang mengapung diantara keduanya adalah
lapisan yang mengandung protoplas viabel. Lapisan inilah yang
secara perlahan diambil, dipindahkan ke tabung reaksi lain untuk
dilakukan pencucian sama dengan prosedur pencucian sebelumnya
sampai akhirnya diperoleh sejumlah protoplas viabel yang siap
dikultur ataupun diperkakukan yang lain.
Pertanyaan : Permunian protoplas perlu dilakukan. Mengapa ?
Bagaimana cara yang harus dilakukan untuk mendapatkan protoplas
‘murni’ ? Tahapan apa yang perlu dilakukan untuk untuk pemurnian
protoplas ? Kondisi apa yang perlu diperhatikan untuk mendapat
kualitas dan kuantitas protoplas yang baik ? Bagaimanakah posisi
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………l
Kultur jaringan Tumbuhan - Semester Genap 2002-2003
arutan protoplas murni, debris dan supernatan selam purifikasi atau
pemurnian ?
FUSI PROTOPLAS / HIBRIDISASI SOMATIK
Fusi protoplas adalah ……………………… tujuannya adalah
………………….. proses ini menunjang program hibridisasi somatik
Ada 2 metode fusi yaitu secara kimiawi dan elektris. Proses yang
dimaksud untuk masing-masing metode tersebut adalah
……………….Apa kelemahan dan keuntungan masing-masing
metode tersebut ? Apa yang dimaksud homokarion ? heterokarion ?
sibrid ?
Beberapa hal yang dapat menginduksi fusi adalah ………………….
Hasil fusi yang didapatkan adalah fusi biner. Apa fusi biner ?
mengapa dianggap lebih baik ?
Permasalahanmendasar yang harus dipahami pada fusi protoplas
adalah ……………..
Beberapa hal penentu keberhasilan fusi protoplas adalah
…………….
Setelah fusi perlu dilakukan seleksi hasil fusi dan uji viabilitas. Apa
yang dimaksud dengan hal tersebut ? Mengapa perlu dilakukan ?
KULTUR PROTOPLAS atau KULTUR HASIL FUSI
Viabiltas kondisi k ultur yang perlu diperhatikan adalah
………………………….. Mengapa kerapatan protoplas menjadi suatu
hal penting dalamkultur ? Bagaimana komposisi medium,
kondisilingkungan serta jenis atau teknik kulturnya ?
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi regenerasi protoplas, yaitu
respon stres, mekanisme ‘perbaikan’, dediferensiasi, pembelahan
sel, serta morfogenesis. Apa yang dimaksud dengan masing-masing
faktor tersebut ?
Bagaimana metabolisme protoplas pada medium kultur ? bagaima
mendeteksi telah terjadi regenerasi dinding sel ?
Teknologi protoplas dapat dimanfaatkan untuk plant breeding dan
beberapa kajian dasar. Apa yang dimaksud dengan hal tersebut ?
Pustaka yang dianjurkan untuk dibaca :
Kultur jaringan Tumbuhan - Semester Genap 2002-2003
TOPIK XII. SENYAWA METABOLIT SEKUNDER DALAM KULTUR
JARINGAN TUMBUHAN
Tanaman merupakan sumber senyawa fitokimia, baik metabolit
primer maupun sekunder. Senyawa metabolit sekunder merupakan
sumber yang penting untuk komposisi mkanan dan senyawa
fitokimia pencegah penyakit (2). Senyawa sekunder menarik
perhatian karena perbedaan fungsinya dan aktivitas biologisnya
sebagai: antimikrobial, antibiotik, insektisida, moluskisidal serta
aktivitas farmakologi maupun farmaseutikal lainnya (5 & 6). Selain
untuk pengobatan tradisional senyawa tersebut juga digunakan
dalam industri kosmetik dan pangan (5). Agar metabolit sekunder
bisa diproduksi : berbagai enzim yang terlibat langung dalam
metabolisme sekunder harus diinduksi dan ketersediaan prekursor
yang sesuai dari metabolisme primer. Karena metabolisme primer
tidak hanya menghasilkan prekursor metabolisme sekunder tetapi
juga prekursor untuk sintesis konstituen sel. Penelitian-penelitian
memfokuskan pada dua hal : i) mendeteksi senyawa bioaktif baru
yang bermanfaat langsung pada penyembuhan berbagai penyakit
atau sebagai bahan awal dalam mensintesis senyawa yang bernilai
tinggi, dan ii) pembentukan produk-produk melalui sistem kultur
jaringan dan sel untuk memahami biositesisnya, isolasi enzim yang
terlibat sebagai katalis dan memanipulasi dan memperbaiki sintesis
produk pada sistem tersebut. Selain senyawa baru penelitian juga
dilakukan untuk meningkatkan keterbatasan penyediaan senyawa
yang sudah diketahui, contohnya : taxol, asam jasmonat dan metil
ester dari asam jasmonat. Beberapa hasil penelitian menunjukkan
bahwa tanaman dapat menghasilkan senyawa fitokimia dengan
aktivitas biologi yang ‘impressive’. Tetapi karena keterbatasan dalam
penyediaannya, maka pengembangan sistem kultur dan khususnya
kultur sel tanaman mungkin merupakan salah satu cara yang bisa
mengatasi problem dalam penyediaannya (2). Kultur sel tanaman
dianggap merupakan bentuk kultur jaringan tanaman yang paling
bisa beradaptasi (initiate, maintain and scale-up) dari sisi skala
produksi walaupun kultur yang berdiferensiasi (tunas, akar, embrio)
juga diketahui dapat mengahsilkan produkalami dalam jumlah
banyak (5).
Kemampuan suspensi sel tumbuhan sebagai sumber produk
alami dipengaruhi oleh : kesesuaian nutrisi medium, aplikasi
fitohormon (sitokinin dan auksin). Sampai tahun 1992 sudah 140
jenis senyawa sekunder baru yang ditemukan melalui kultur jaringan
dan sel tanaman. Suspensi sel telah banyak mengahasilkan produk
alami dari semua kelompok metabolit sekunder yang ada
(fenilpropanoid : 10 jenis, alkaloid : 10 jenis, Terpenoid : 5 jenis dan
Quinon : 3 jenis). Walaupun banyak penelitian menunjukkan bahwa
laju produksi senyawa alami di sistem kultur melebihi yang ada di
tanaman secara alami, tetapi kenyataan lain menunjukkan bahwa
senyawa dengan nilai komersial yang cukup tinggi sering tidak
dihasilkan melalui kultur (6).
Beberapa tipe metabolit sekunder dapat dideteksi dengan
mikroskop cahaya karena terletak di vakuola dengan berbagai warna
yang dihasilkan. Tetapi sebagian besar metabolit sekunder yang
penting tidak berwarna sehingga untuk mendeteksinya harus
melakukan kombinasi prosedur ekstraksi dan metode pemisahan
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
Kultur jaringan Tumbuhan - Semester Genap 2002-2003
yang akan lebih baik bila diikuti dengan purifikasi. Metode yang
sering dilakukan adaah : HPLC, GC, elektroforesis kertas atau TLC.
Karena kultur sel hanya mengakumulasi fraksi dari produk sekunder
yang dijumpai di tanaman asalnya maka prosedurnya harus
mengalami modifikasi. Kelemahannya, akan mengandung banyak
‘kontaminan’ dan bila dihasilkan pada sel yang belum berdiferensiasi
kemungkinan senyawa tersebut disimpan atau terikat pada bagian
lain yang tidak bisa didapat dengan ekstraksi secara konvensional.
Sumber pustaka :
(1) Bassetti, L. dan J. Tramper. 1995. Use of non-conventional media
in Morinda citrifolia cell cultures.
(2) Fu, Tong-jen, 1998. Safety considerations for food ingredients
produced
by
plant
cell
and
tissue
culture.
http://pubs.acs.org/hotartcl/chemtech/98/jan/safety.html
(3) Linus, H.W., … 1995. Relation between primary and secondary
metabolism in plant cell suspension.
(4) Luckner, M. …. 1977. Secondary Metabolism and Cell
Differentiation.
(n) Misawa, M. 1994. Plant Tissue Cultre : An Alternative for
Production of Useful Metabolite.
(5) Stafford, A. Natural products and metabolites from plants and
plant tissue culture. dalam A. Stafford dan G. Warren 1993. Plant
Cell and Tissue Culture.
(6) Stockigt, J., ….. 1995. Natural products and enzymes from plant
cell cultures.
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
…………………………………
Fly UP