...

uji stabilitas fisik, kimia dan biologik terhadap formulasi terbaru

by user

on
Category: Documents
3

views

Report

Comments

Transcript

uji stabilitas fisik, kimia dan biologik terhadap formulasi terbaru
MAKARA, KESEHATAN, VOL. 11, NO. 2, DESEMBER 2007: 84-89
UJI STABILITAS FISIK, KIMIA DAN BIOLOGIK TERHADAP
FORMULASI TERBARU LIPOSOM TETRA ETER LIPID (EPC-TEL 2,5)
SEBAGAI PEMBAWA OBAT (Drug Carrier)
Ernie H. Purwaningsih1, Wawaimuli Arozal2, Sri Widia A. Jusman3
1. Departemen Ilmu Farmasi Kedokteran, Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta 10430, Indonesia
2. Departemen Farmakologi dan Terapeutik, Fakultas Kedokteran, Universita Indonesia, Jakarta 10430, Indonesia
3. Departemen Biokimia dan Biomolekular, Fakultas Kedokteran, Universita Indonesia, Jakarta 10430, Indonesia
E-mail: [email protected]
Abstrak
Telah dilakukan penelitian untuk menguji stabilitas fisik dan kimia secara in vitro dan stabilitas biologik secara in vivo
terhadap formula terbaru liposom EPC-TEL2,5. Liposom sebagai pembawa berbagai obat (drug carrier) yang
berukuran 50 – 200 nanometer, merupakan salah satu produk teknologi nano (nanotechnology). Liposom ini merupakan
formulasi terbaru yang mengandung lesitin / fosfatidilkolin kuning telur (egg yolk phosphatidyl choline=EPC dan Tetra
eter lipid (TEL) 2,5 mol % dari Sulfolobus acidocaldarius atau Thermoplasma acidophilum.yang kemudian dinamakan
sebagai liposom EPC-TEL2,5, belum pernah diuji stabilitasnya. Pada penelitian ini digunakan TEL dari Thermoplasma
acidophilum. Kestabilan liposom dalam membawa obat hingga mencapai organ sasaran akan sangat menentukan dosis
terapi obat. Uji kestabilan liposom EPC-TEL2,5 dilakukan pada liposom tanpa perlakuan (tanpa ekstrusi atau sonikasi),
liposom hasil ekstrusi membran 200 nm, dan liposom hasil sonikasi. Secara fisik, uji dilakukan dengan cara mengukur
jumlah dan diameter partikel liposom setelah penyimpanan pada suhu 4º C, suhu kamar, dan 37º C. Secara kimia
dengan mengukur jumlah dan diameter partikel liposom setelah pemaparan garam NaCl; CaCl2; MgCl2 pada pH 5; 7; 9.
Pengukuran jumlah dan diameter partikel liposom ke dua jenis uji stabilitas dilakukan pada hari I; hari VII; akhir bulan
I; bulan II, dan bulan III. Secara biologik dilakukan pengukuran hasil degradasi TEL pada menit ke 0; 30; 60; jam ke 2;
4; dan 8 setelah penyuntikan liposom EPC-TEL2,5 secara IP, pada mencit. Hasil uji menunjukkan bahwa liposom
tampak stabil hingga akhir bulan I pada suhu 4º C dan 37º C pada uji stabilitas fisik; tetap stabil hingga akhir bulan II
pada uji stabilitas kimia pada larutan garam NaCl; CaCl2 pada pH 5 dan 7. Liposom EPC-TEL2,5 terdegradasi di hepar
mencit pada uji stabilitas biologik.
Abstract
The Physical, Chemical, and the Biological stability test on Liposome EPC-TEL 2.5 as the newest drug delivery
systems (drug carrier), in vitro and in vivo. This experiment is carried out in order to improve the stability of the
Liposome EPC-TEL 2.5 physically, chemically, and biologically. As a new formula, this liposome that has contained
phosphatidylcholine from egg yolk=EPC and Tetra-ether Lipid (TEL) from membrane of Sulfolobus acidocaldarius or
Thermoplasma acidophilum had never been tested on their stability. The stability of liposome to carry the drug into the
targeted cells or organs is required for determining the therapeutic dose of the drugs. Physically, the test was done by
measuring the amount and diameter of liposome after incubating at 4º C, at room temperature, and 37º C. Chemically,
the test was also done using the same parameters after introduction of chemical solution of NaCl, CaCl2; MgCl2 at the
pH of 5; 7; 9. The measurements was carried out on day 1; 7; and month 1; 2; and 3. Biologically, liposome EPC-TEL
2.5 was injected Intra-Peritoneally to mice to detect the degradation of TEL in their liver, at the minute of 0; 30 ; 60 ;
the hour of 2; 4; and 8. The results of these tests were shown that liposome EPC-TEL 2.5 was stable until the last month
of 1 at 4º C and 37º C on physical stability test; more stable at the chemical solution of NaCl and CaCl2 at the pH of 5
and 7 until two months; and TEL was degradable in liver of mice.
Keywords: liposome, EPC-TEL2.5, stability, nanotechnology
untuk terus diteliti dengan upaya mendapatkan obat
yang aman dan lebih efektif dengan efek samping yang
seminimal mungkin. Hal ini disebabkan karena obat
antikanker ataupun imunosupresan yang tersedia masih
1. Pendahuluan
Dewasa ini, beberapa penyakit serius misalnya kanker
dan gangguan imunologik menjadi perhatian para ahli
84
85
MAKARA, KESEHATAN, VOL. 11, NO. 2, DESEMBER 2007: 84-89
banyak menimbulkan efek samping dibandingkan
manfaat obat karena dibutuhkan dosis tinggi untuk
jangka pemberian yang cukup lama 1. Salah satu cara
menurunkan efek samping tersebut adalah dengan
menginkorporasikan
obat
antikanker
ataupun
imunosupresan ke dalam pembawa obat (drug carrier)
yang telah banyak diteliti yaitu liposom 2-4.
Liposom yang mempunyai gambaran mirip dengan sel
yang bermembran dua lapis fosfolipid, .merupakan
suatu pembawa obat. Liposom umumnya dibuat dari
lesitin atau fosfatidilkolin dari kedelai (Soya bean
Phosphatidylcholine/SPC) atau dari kuning telur (Eggyolk Phosphatidylcholine/EPC) 5. Selain fosfatidilkolin
sebagai lipid utama, liposom dapat juga dibuat
kombinasi dengan lipid lain untuk meningkatkan
stabilitas liposom, misalnya kolesterol atau tetra eter
lipid (TEL) 6-8.
Tetra eter lipid merupakan lipid membran bakteri
Archaea yang akhir-akhir ini banyak diteliti sebagai
lipid utama pada formulasi liposom per oral, karena
stabil pada pH 2. Bakteri Archaea yang sudah banyak
diekstrak
untuk
mendapatkan
TEL
adalah
Thermoplasma
acidophilum7
dan
Sulfolobus
acidocaldarius8 . . Pada penelitian ini digunakan TEL
dari Thermoplasma acidophilum.
Liposom kombinasi EPC-TEL 2,5 terbukti dapat
mengikat obat lebih baik dibandingkan liposom EPC
atau liposom jenis lain9-10, namun belum pernah
dilakukan uji stabilitas liposom EPC-TEL 2,5 terhadap
pengaruh fisik (perbedaan suhu), pengaruh bahan kimia
yaitu NaCl, MgCl2 dan CaCl2 pada berbagai pH dan
pengaruh metabolisme di hepar pada uji stabilitas
biologik.
Apabila liposom EPC-TEL 2,5 cukup stabil pada uji
stabilitas fisik dan kimia, tidak stabil pada uji stabilitas
biologik, maka formulasi terbaru liposom tersebut dapat
dimanfaatkan untuk menginkorporasikan obat-obat,
terutama obat yang hanya efektif pada dosis tinggi
ataupun obat-obat untuk jangka panjang, sehingga efek
toksik obat dapat ditekan serendah mungkin.
2. Metode Penelitian
Tempat Penelitian: Departemen Ilmu Farmasi
Kedokteran, Departemen Farmakologi, Departemen
Biokimia, Departemen Fisika Kedokteran, Fakultas
Kedokteran Universitas Indonesia. Lama Penelitian: 10
bulan, Oktober 2006 – Juli 2007
Tahap 1
Preparasi liposom EPC-TEL2,5 (Ernie HP) 10
• Liposom diekstrusi dengan ekstruder Avestin®,
membran berpori 100 dan 200 nmÆ liposom
unilamelar berukuran 100-200 nanometer).
•
Liposom sonikasi (bath sonicator )Æ unilamelar
berukuran <100 nm.
Tahap II
Uji stabilitas in vitro :
A. Fisik: pengukuran besar partikel dan jumlah
liposom EPC-TEL2,5 :
- 4 kelompok : 1) sebelum ekstrusi; 2) ekstrusi 200
nm; 3) ekstrusi 100 nm; 4) sonikasi
- Setiap kelompok dibagi ke dalam 3 subkelompok
observasi suhu inkubasi (4 sampel/subkel.) +
penanda liposom Quinacrin 0.05 %: suhu kamar
(≥20° C ), suhu 37° C dan 4° C.
- Observasi hari pertama, akhir minggu pertama,
akhir bulan I, akhir bulan ke II dan akhir bulan ke
III (3 bulan).
- Pengukuran :
a. Metode van Renswoude, dkk 11 : modifikasi
elektroforesis untuk mengukur besar
liposom.
b. Modifikasi mikroskop fluoresens untuk
mengukur besar (diameter dengan skala
Olympus) dan jumlah liposom.
B. Kimiawi (Metode Freisleben HJ,dkk 12 dan New
RC, dkk 13).
- 4 kelompok : 1) sebelum ekstrusi; 2) ekstrusi 200
nm; 3) ekstrusi 100 nm; 4) sonikasi
- Setiap kelompok dibagi ke dalam 2
subkelompok: 150 dan 350 mMol + penanda
liposom Quinacrin 0,05 %.
- Masing-masing subkelompok dibagi 3 subsubkelompok elektrolit NaCl, MgCl2 , CaCl2
dengan pH masing-masing 5; 7; dan 9 , 3
sampel/sub-sub kelompok.
- Uji pada hari I Æakhir minggu I, akhir bulan I,
akhir bulan ke 2, dan akhir bulan ke 3
penyimpanan pada suhu 4°C
- Pengukuran:
a. Metode van Renswoude, dkk11 : modifikasi
elektroforesis untuk mengukur besar liposom
b. Modifikasi mikroskop fluoresens untuk
mengukur besar (diameter, skala Olympus)
dan jumlah liposom
C. Uji stabilitas biologik in vivo:
Untuk menilai dekomposisi (degradasi) TEL murni dan
atau EPC-TEL2,5 dengan cara:
- 24 ekor mencit C3H jantan dan betina 12-15
minggu, 20-25 g, dibagi 6 kelompok ekstraksi
hepar pada menit ke 0; 30; 60; dan jam 2; 4; dan 8.
- Dosis liposom EPC-TEL 2,5 sebesar 10 mmol
/ekor, IP
- Ekstrak hepar disimpan pada suhu 4° C sebelum
semua ekstrak terkumpul.
86
MAKARA, KESEHATAN, VOL. 11, NO. 2, DESEMBER 2007: 84-89
-
-
-
Hasil dekomposisi TEL diukur dengan TLC- gel
silika60 F254 (Merck) dengan kontrol TEL murni
pada dosis 200; 300; 400 ug.
Pewarna bercak campuran tembaga asetat 3% dan
asam fosfat 8% dengan pemanasan 180° C selama
10 menit.
Bercak di”scan” dengan program Presto Page
Manager dan kadar TEL/degradasi diukur semi
kuantitatif pada program Adobe Photo Shop 7.01
A
Bulan 1
Telah dilakukan pembuatan liposom EPC-TEL 2,5 dan
uji stabilitas kimia (NaCl dan MgCl2 350 mmol) pada
gel sepharose untuk mengukur besar liposom
Bulan 2
Berdasarkan hasil penelitian awal tersebut yaitu bahwa:
a. Rf hasil ekstrusi 100 nm dan 200 nm sama, maka
ekstrusi dengan membran100 nm tidak dilanjutkan
b. Pengukuran besar (diameter) dan jumlah liposom
digunakan modifikasi mikroskop fluoresens (hasil
inovasi Dep. Fisika FKUI)
Hasil Uji Stabilitas Fisik menunjukkan bahwa jumlah
dan diameter liposom EPC-TEL 2,5 tampak tetap stabil
hingga akhir bulan I terutama pada suhu 4°C dan 37°C
(p<0,000; hasil uji statistik tidak ditampilkan). Dalam
naskah ini hanya ditampilkan gambaran liposom pada
suhu 37°C, hasil ekstrusi 200 nm dan sonikasi
dibandingkan dengan liposom tanpa perlakuan (tanpa
ekstrusi/sonikasi). Lihat Gambar 1.
Pada uji stabilitas kimia menunjukkan hasil bahwa
larutan NaCl dan CaCl2 pada pH 5 dan 7, terutama
larutan kimia 350 mMol tampak tetap stabil dan berbeda
bermakna dibandingkan dengan larutan yang sama
pada pH 9 dan dengan larutan MgCl2 pada berbagai pH
terutama pada liposom hasil sonikasi (p<0,000; hasil
analisis statistik tidak ditampilkan). Hasil uji hanya
ditampilkan pada pH 7, lihat Gambar 2 dan 3.
C
Hari 7
3. Hasil dan Pembahasan
Dari hasil penelitian awal disimpulkan bahwa:
a. Faktor retensi ( Rf) sampel 2-9 : 1,7 –1,9 Æ tidak
ada perbedaan besar / ukuran partikel liposom tanpa
atau dengan ekstrusi dan sonikasi
b. Minggu 1 dan ke 4 Æ tidak ada perbedaan ukuran
partikel liposom (Rf: sama)
c. Dengan mikroskop fluoresensÆ ukuran partikel
tidak berubah yaitu berkisar 100 nm (data tidak
dapat dipublikasikan)
d. Pada akhir minggu ke 8 Æ liposom tanpa bahan
kimia tampak cenderung bergerombol
B
Hari 1
Bulan 3
D Kontrol Quinacrine
Gambar 1. Gambaran liposom pada uji stabilitas fisika,
suhu 37°C, pembesaran 400 X (A. Hasil
sonikasi; B. Hasil ekstrusi 200 nm; C. Kontrol
tanpa perlakuan; D. Lar. Quinacrine 0,05%).
Hasil uji stabilitas biologik menunjukkan bahwa TEL
dalam liposom EPC-TEL 2,5 tidak terdeteksi pada
seluruh waktu pengambilan sampel (Gambar 4). Hal ini
menunjukkan bahwa TEL didegradasi oleh hati. Hasil
ini didukung pula bahwa secara eks vivo, ekstrak hati
mencit yang ditambah dengan liposom EPC-TEL 2,5
tidak tampak adanya TEL pada TLC ( K+TEL).
Hasil uji stabilitas fisik menunjukkan bahwa liposom
EPC-TEL 2,5 tampak stabil hingga akhir bulan I pada
suhu 4° C dan 37° C, sedangkan uji stabilitas kimia
tampak stabil hingga akhir bulan II, terutama dalam
larutan NaCl dan CaCl2 pada pH 5 dan 7. Hasil ini agak
mirip dengan liposom TEL (tetra eter lipid) murni
(Freisleben12) yang tterbukti stabil hingga 3 bulan
penyimpanan pada suhu 4° C.
Jumlah liposom EPC-TEL 2,5 tampak berkurang pada
akhir bulan ke 3 karena sebagian bergumpal, sedangkan
diameter relatif tetap (analisis statistik tidak
ditampilkan).
87
MAKARA, KESEHATAN, VOL. 11, NO. 2, DESEMBER 2007: 84-89
CaCl2
MgCl2
NaCl
Hasil Uji Stabilitas Biologik
Hari 1
Hari 7
Bulan 1
TEL 200,300,400
ug
K K 30’ 1j 2j
+TEL
4j
8j
4j
8j
Bulan 2
Bulan 3
TEL 200,300,400
μg
K
K
K 30’ 1j
+TEL
2j
Quinacrine 0,05 %
Gambar 2. Gambaran liposom hasil sonikasi pada uji
stabilitas kimia 150 mMol, pH 7, pembesaran
400 X.( K: kontrol tanpa perlakuan)
CaCl2
MgCl2
NaCl
Hari 1
TEL 200,300,400
μg
K K 30’
+TEL
1j
2j
4j
TEL 200,300,400
μg
K
1j
2j
4j
8j
Hari 7
Bulan 1
K
30’
+TEL
8j
Bulan 2
Gambar 4. Hasil degradasi TEL di liver (hati) mencit
setelah penyuntikan liposom EPC-TEL 2,5: 10
mMol, IP
Bulan 3
K
Gambar 3. Gambaran liposom hasil sonikasi pada uji
stabilitas kimia 350 mMol, pH 7, pembesaran
400 X ( K: kontrol tanpa perlakuan)
Perhitungan jumlah dan pengukuran diameter liposom
tetap dapat dilakukan walaupun secara manualÆ lebih
murah karena peralatan untuk pengukuran tersebut
sangat mahal.
Gambaran liposom cukup jelas tanpa mikroskop
fluoresensÆ mirip dengan hasil pemeriksaan oleh van
Renswoude,dkk11. Data terekam dengan inovasi
mikroskop oleh staf Dep. Fisika FKUI.
MAKARA, KESEHATAN, VOL. 11, NO. 2, DESEMBER 2007: 84-89
Wendy, Aditya, Dwi, Satrio, Dorthea, Agung, Angga,
Wahyu, Fatimah, Yani.
KURVA KALIBRASI
1000000
Daftar Acuan
800000
Integral
88
gelombang 1
600000
gelombang 2
400000
gelombang 3
200000
0
200mg 300mg 400mg
Konsentrasi TEL
Gambar 5. Kurva kalibrasi TEL murni sebagai kontrol
pada pengukuran degradasi TEL di hati
mencit
Deteksi liposom menggunakan zat fluoresens
(Quinacrine) yang lazim digunakan di Dep. Biologi
FKUIÆ lebih murah dan mudah didapat.TEL pada
penelitian ini merupakan lipid dari Thermoplasma
acidophilum sesuai penelitian Freisleben 3, tetapi hasil
stabilitas biologik mirip dengan hasil penelitian Ernie9
yang menggunakan TEL dari Sulfolobus acidophilus
pada uji distribusi liposom.
4. Kesimpulan dan Saran
(a) Liposom EPC-TEL 2,5 cukup stabil hingga 1 bulan
penyimpanan secara fisik, terutama pada suhu 4°
dan 37° C, sedangkan secara kimia terutama NaCl,
CaCl2 dalam larutan 350 mMol tetap stabil hingga
akhir bulan II, pada pH 5 dan 7.
(b) Liposom EPC-TEL 2,5 tidak stabil pada uji
stabilitas biologik Æ terdegradasi di hati mencit,
namun tidak / belum diketahui hasil degradasi TEL
Saran:
(a) Diperlukan inovasi peralatan pengukuran diameter
dan perhitungan jumlah liposom yang lebih akurat,
(b) Diperlukan uji degradasi lebih lanjut untuk
mengetahui hasil degradasi / metabolisme TEL.
Ucapan Terima Kasih
Peneliti mengucapkan terima kasih yang tak terhingga
kepada Pimpinan dan Staf Direktorat Riset dan
Pengabdian Masyarakat Universitas Indonesia (DRPM
UI) yang telah mendanai penelitian ini. Terima kasih
saya sampaikan untuk para pembimbing mahasiswa
Dra. Ida Hafiz, Apt.MSi; dr. Siti Farida, MKes; Drs.
Yulhasri, MBiomed; serta anak-anakku mahasiswa
FKUI angkatan 2005-2006: Lisa, Bhisma, Eki, Prima,
Vania, Nina, Nelfi, Yenni, Venesa, Widya, Rachma,
1.
Chabner BA Ryan DP, Paz-Ares L, GarciaCarbonero R, Calabresi P. Antineoplastic agents.
In : Hardman JG, Limbird LE (eds). Goodman and
Gilman’s The Pharmacological Basis of
Therapeutics, 10th ed. Maxwell Macmillan Int.
Edition 2001: 1389-1459.
2. Lasic DD.(ed). Liposomes as a drug delivery
system Liposomes from Physics to Application.
Elsevier Science Publisher BV 1993:265-324.
3. Freise CE, Liu T, Hong K, et al. The increased
efficacy and decreased nephrotoxicity of
cyclosporine
liposome.
Transplantation
1994;579(6):928-32.
4. Huang SK, Mayhew E, Gilani S, Lasic DD, Martin
FJ, Papahadjopoulos D. Pharmacokinetics and
therapeutics of sterically stabilized liposomes in
mice bearing C-26 colon carcinoma. Cancer
Research 1992;52:6774-81.
5. Lasic DD(ed.). Chemistry of lipids and liposomes.
In : : Liposomes from Physics to Application.
Elsevier Science Publisher BV 1993: 1-42.
6. New RRC. Preparation of liposomes. In: New RRC
(ed.). Liposomes. A Practical approach. IRL Press
1991: 33-104.
7. Freisleben HJ, Antonopoulos E, Rothe U,
Bakowsky U. Tetraetherlipide und diese
enthaltende liposome sowie deren verwendung.
Patents: P 19607722.2, 1996; PCT/EP 97/01011,
1997.
8. Sugai A, Sakuma R, Fukuda I, Kurosawa N, Itoh
YH, Kon K, Ando S, Itoh T. The structure of the
core polyol of the ether lipids from Sulfolobus
acidocaldarius. Lipids 1995;30(4):339-44.
9. Purwaningsih EH, Freisleben HJ, Sadikin M.
Peningkatan inkorporasi metilprednisolon palmitat
pada liposom yang mengandung tetraeter lipid dari
membran Sulfolobus acidocaldarius membentuk
sediaan baru liposomal metilprednisolon palmitat.
Jurnal Farmasi Indonesia 2002;1(1):24-30.
10. Purwaningsih EH, Sadikin M, Soeradi O, Rasad A,
Freisleben
HJ.
Distribusi
liposomalmetilprednisolon palmitat (L-MPLP) pada beberapa
organ mencit setelah pemberian intraperitoneal.
Makara. Seri Kesehatan 2004;2(8):65-72.
11. Van Renswoude AJBM, Blumenthal R, Weinstein
JN. Thin-layer chromatography with agarose gels.
A quick, simple method for evaluating liposome
size. Biochim Biophys Acta 1980;595:151-6.
12. Freisleben HJ. The mainphospholipid of the
Archaebacterium Thermoplasma acidophilum.
Does the Liposome Technology with this unique
Tetraether lipid provide novel perspectives for
Biochemistry and Medicine? (Title translated from
89
MAKARA, KESEHATAN, VOL. 11, NO. 2, DESEMBER 2007: 84-89
German to English). Habilitation at JohannWolfgang, Goethe-University, Frankfurt am Main,
1992.
13. New RRC. Characterization of liposomes. In: New
RRC (ed.). Liposomes. A Practical Approach. IRL
Press 1991: 105-61
Fly UP