...

ISOLASI DAN KARAKTERISASI LINAMARASE HASIL ISOLASI

by user

on
Category: Documents
6

views

Report

Comments

Transcript

ISOLASI DAN KARAKTERISASI LINAMARASE HASIL ISOLASI
138
Isolasi dan Karakterisasi Linamarase...(Askurrahman)
ISOLASI DAN KARAKTERISASI LINAMARASE HASIL ISOLASI DARI
UMBI SINGKONG (MANIHOT ESCULENTA CRANTZ)
Askurrahman
Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas Trunojoyo
Korespondensi : Jl. Raya Telang PO BOX 2 Kamal-Bangkalan, Email: [email protected]
ABSTRACT
The purpose of this research was to know the optimum condition of linamarase
enzymatic reaction from bitter cassava. These studies are designed in several stages of interrelated. Starting with the determination of cyanide content of cassava tubers, Isolation and
characterization linamarase on cassava tuber. The research result showed that linamarase had
optimum condition in some activities; pH for about 6, temperature for about 40OC, incubation
period for about 3 hours, and Km for about 0.012% and Vmaks for about 0.296 unit.
Key Words: Isolation, Characterization, Linamarase, Cassava (Manihot esculenta Crantz)
PENDAHULUAN
Singkong
(Manihot
esculenta
Crantz) merupakan tanaman yang sangat
populer di seluruh dunia, khususnya di
negara-negara tropis. Di Indonesia, singkong
memiliki
arti
ekonomi
terpenting
dibandingkan dengan jenis umbi-umbian yang
lain. Singkong (Manihot esculenta Grant)
merupakan salah satu bahan pangan yang
utama. Di Indonesia, singkong merupakan
makanan pokok ke tiga setelah padi-padian
dan jagung (Chalil, 2003).
Singkong mengandung senyawa
glukosida sianogenik, yang tersebar hampir
pada semua jaringan tanaman, yang terdiri
atas linamarin dan lotaustrain dengan
perbandingan 10:1 (dimana senyawa ini dapat
berubah menjadi sianida yang sangat beracun)
(Djazuli dan Bradbury, 1999; Nambisan,
1999). Mkpong et al. (1990), mengatakan
bahwa hidrolisis linamarin dengan linamarase
menghasilkan aseton sianohidrin dan glukosa.
Aseton sianohidrin secara spontan pada pH di
atas 5 menghasilkan asam sianida (HCN) dan
aseton. Berdasarkan penelitian yang dilakukan
oleh Yeoh (1997) diketahui bahwa kandungan
glukosida sianogenik pada singkong di
Indonesia berkisar 20 ppm sampai 200 ppm.
Sedangkan menurut FAO/WHO 1991 dalam
Iglesias et al. (2002), kandungan sianida yang
diperbolehkan pada makanan dari singkong
maksimal 10 ppm. Maka diperlukan upaya
menurunkan kandungan glukosida sianogenik
pada umbi singkong.
Penggunaan singkong sebagai bahan
makanan
sering
dihadapkan
dengan
permasalahan kesehatan, karena masih
tertinggalnya kandungan glukosida sianogenik
termasuk linamarin yang tidak terhidrolisis
pada saat proses pengolahan (Mkpong et al.,
1990). Hidrolisis linamarin oleh linamarase
menghasilkan aseton sianohidrin dan glukosa.
Oleh sebab itu, penurunan kandungan sianida
pada umbi singkong sangat diperlukan untuk
keamanan
pangan.
Umbi
singkong
menghasilkan linamarase (Mkpong et al.,
1990).
Pada proses pengolahan pangan
sianida pada singkong dihilangkan dengan
merebus dan membuang air perebus. Akan
tetapi, proses pemasakan secara tradisional
baik dengan cara direbus maupun digoreng
tidak dapat menghilangkan sempurna senyawa
sianida. Maka diperlukan upaya penurunan
kandungan glukosida sianogenik dengan
mengoptimalkan proses hidrolisis glukosida
sianogenik oleh linamarase.
Linamarase (EC.3.2.1.21) yang
diisolasi dari singkong sampai saat ini belum
banyak ditentukan karakternya. Linamarase
menghidrolisis linamarin menjadi asam
sianida, perlu dipelajari kondisi optimum yang
dapat mempengaruhi kerja enzim linamarase,
misalnya pengaruh suhu, pH subsrat, waktu
inkubasi dan penentuan karakter Km
AGROINTEK Vol 4, No. 2 Agustus 2010
(konstanta hubungan antara laju reaksi antara
tahap-tahap reaksi enzim dan merupakan
jumlah konsentrasi substrat untuk mencapai
aktivitas enzim setengah maksimum) dan
Vmaks
(kecepatan
aktivitas
enzim
maksimum).
Tujuan dari penelitian ini adalah
sebagai berikut; Mengetahui kandungan
sianida pada umbi singkong, Mengetahui
kondisi optimum reaksi enzimatis linamarase
hasil isolasi dari singkong pahit.
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah singkong pahit varietas
lokal yang berumur 1 tahun diperoleh dari
Desa Kertagena Tengah, Kecamatan Kadur,
Kabupaten Pamekasan. Bahan kimia yang
digunakan adalah aquades, NaOH 2.5%,
Na2CO3, asam pikrat, Kloroform, asam sitrat,
kalium dihidrogen fosfat, asam borat, NaOH
0.2 M, PMSF, Ammonium Sulfat, HCl,
BaCL2, Metanol (99.5%), KCN, TCA 4%,
BSA, Reagen Biuret.
Penentuan Kadar Sianida
Singkong
diparut
kemudian
ditimbang 20 g singkong, dimasukkan dalam
labu Kjedahl, selanjutnya ditambahkan 100 ml
aquades. Dimaserasi selama (0, 2, 4, 6, 8, 10
dan 12 jam). Kemudian distilasi secara steam
destilation.
Distilat
ditampung
dalam
erlenmeyer yang telah diisi dengan 20 ml
NaOH 2,5%, dan distilasi dihentikan setelah
dipastikan destilat hingga ± 150 ml. Diambil 5
ml distilat, dimasukkan ke dalam tabung
reaksi, ditambahkan 5 ml Natrium Pikrat dan
0.5 ml kloroform. Kemudian dihomogenizer
dan didiamkan selama 30 menit dan
selanjutnya dibaca absorbansinya dengan
menggunakan spektronik 20.
Isolasi Linamarase dari Singkong
Singkong
diparut,
kemudian
ditimbang sebanyak 100 g, ditambahkan 100
ml 0,1 M buffer sitrat fosfat pH 7 dan 0.25 ml
PMSF (phenylmethenesulfonyl fluoride), di
blender pada suhu dingin, disonikator selama
kurang lebih 5 menit dan selanjutnya disaring.
Filtrat dimasukkan ke dalam beker, dan
disentrifugasi 4.000 rpm selama 10 menit.
139
Supernatan yang dihasilkan merupakan enzim
kasar (crude enzim).
Enzim kasar kemudian diendapkan
dengan Ammonium Sulfat Jenuh (SAS) 40%.
Sebanyak 50 ml larutan ekstrak kasar enzim
dimasukkan ke dalam gelas beker 250 ml,
ditambah ammonium sulfat 12.15 g.
Penambahn dilakukan sedikit demi sedikit
disertai pengadukan perlahan-lahan, larutan
dipertahankan pada suhu 4-25OC selama 30
menit. Kemudian disentrifuse dengan
kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan yang diperoleh dipisahkan dari
endapan.
Endapan dilarutkan ke dalam 5 ml
larutan buffer sitrat fosfat pH 7. Masingmasing larutan enzim dimasukkan ke dalam
kantong selofan, kemudian direndam dalam
300 ml larutan buffer sitrat fosfat 0,05 M pH 7
selama semalam. Dialisis dilakukan sampai
garam terpisah. Untuk mengujinya, 5 ml
buffer diambil dan dimasukkan tabung reaksi,
kemudian ditambah 1 ml HCl 0,1 M dan
beberapa tetes BaCl2 0,1 M. Apabila tidak
terbentuk endapan, maka dialisis dihentikan.
Penentuan Aktivitas Linamarase
Dicampur 1,25 ml ekstrak kasar
linamarin dengan konsentrasi 12%, 1 ml
larutan buffer sitrat fosfat pH 7; 1 ml
linamarase, 0,01 ml kloroform dan 1 ml
larutan natrium pikrat lalu diinkubasi selama 3
jam pada suhu 33oC. Larutan ditambah 2,5 ml
larutan TCA 4% (b/v) dan didiamkan selama
30 menit pada suhu kamar. Kemudian
disentrifuse dengan kecepatan 4000 rpm
selama 5 menit, untuk pemisahan filtrat dan
endapan yang terbentuk. Filtrat diambil 1 ml
dan diencerkan sampai 10 ml lalu diukur
absorbansinya pada λmaks komplek sianida.
Blangko yang digunakan dibuat dengan
terlebih dahulu menambahkan TCA ke dalam
larutan enzim, kemudian ditambahkan ekstrak
kasar linamarin dan larutan yang lainnya
sesuai dengan prosedur penentuan aktivitas
enzim. Nilai aktivitas enzim diukur dari kadar
sianida yang diperoleh hasil plot terhadap
kurva baku komplek sianida. Satu unit
aktivitas enzim dinyatakan sebagai μmol
sianida yang dibebaskan atau dihidrolisis
setiap 1 ml volume enzim per menit pada
kondisi tertentu. Pengukuran aktivitas enzim
dilakukan dengan mengkonversi nilai serapan
140
Isolasi dan Karakterisasi Linamarase...(Askurrahman)
menjadi konsentrasi komplek sianida (μg/mL)
dengan menggunakan kurva baku komplek
sianida.
Aktivitas 
CN 

BM CN
x
V
x FP
pxq
Dimana
V = Volume total sample
percobaan pada tiap tabung
(mL)
p = Jumlah enzim (mL)
q = Waktu inkubasi (menit)
FP = Faktor pengenceran
Karakterisasi Linamarase dari Singkong
Penentuan pH Optimum
Penentuan pH optimum aktivitas
linamarase dilakukan dengan menggunakan
range pH 5.0-7.5 dengan selang 0.5, sehingga
didapatkan 6 level perlakuan pH. Selanjutnya
diamati aktivitas linamarase pada tiap level
pH. Salah satu level pH yang menunjukkan
aktivitas enzim tertinggi akan dipakai untuk
pengujian selanjutnya.
Penentuan Suhu Optimum
Penentuan suhu optimum aktivitas
linamarase dilakukan dengan menggunakan
range suhu 30-55oC dengan selang 5oC,
sehingga didapatkan 6 level perlakuan suhu.
Selanjutnya diamati aktivitas linamarase pada
tiap level suhu. Salah satu level suhu yang
menunjukkan aktivitas enzim tertinggi akan
dipakai untuk pengujian selanjutnya.
Penentuan Waktu Inkubasi Optimum
Penentuan waktu inkubasi optimum
aktivitas linamarase dilakukan dengan
menggunakan range waktu 1-6 jam dengan
selang 1 jam, sehingga didapatkan 6 level
perlakuan suhu. Selanjutnya diamati aktivitas
linamarase pada tiap level waktu inkubasi.
Salah satu level waktu inkubasi yang
menunjukkan aktivitas enzim tertinggi akan
dipakai untuk pengujian selanjutnya.
Penentuan Nilai Km dan Vmaks pada
Berbagai Konsentrasi Substrat
Penentuan nilai Km dan Vmax
dihitung pada beberapa level substrat ekstrak
kasar linamarin sebanyak 3, 6, 9, 12, 15 dan
18%. Reaksi antara linamarase dan substrat
dilakukan pada pH optimum, suhu optimum
dan menggunakan waktu inkubasi optimum.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pengaruh Lama Maserasi Terhadap Kadar
Sianida Singkong
Gambar 1. menunjukkan bahwa lama
maserasi dari 0-8 jam terjadi peningkatan
kadar sianida. Hal ini diduga semakin lama
maserasi terjadi hidrolisis prekusor sianida
semakin banyak dan dapat mempercepat
pelarutan senyawa glukosida siangenik,
karena glukosida sianogenik larut dalam air.
Menurut
Pembayun
(2000),
proses
perendaman menyebabkan air berdifusi ke
dalam sel-sel melalui membran sel yang
sangat permiabel. Lama maserasi 8 jam
merupakan lama maserasi optimum dengan
kadar sianida sebesar 208.511 ppm. Hal itu
diduga bahwa pada lama maserasi 8 jam
pemecahan prekusor sianida yaitu glukosida
sianogenik oleh endogenus terjadi secara
maksimal. Prekusor sianida (linamarin dan
otaustrain) dipecah oleh enzim endogenus
yang terdapat dalam umbi singkong. Pada
lama maserasi 8-12 jam kadar sianida pada
umbi singkong menunjukkan konstan. Hal itu
diduga bahwa endogenus yang memecah
prekusor sianida yaitu glukosida sianogenik
mengalami kejenuhan.
Suryani dan Wesniati (2000), pada
umumnya sianida dapat dihilangkan dengan
perebusan dan perendaman sebab sianida
mempunyai sifat fisik mudah larut dalam air
dan mempunyai titik didih 29OC. Anwar
(2004) juga mengatakan bahwa sianida atau
racun pada singkong dapat hilang setelah
pencucian, perendaman, pemasakan dan
pengeringan selama proses produksi beras
singkong semi instan. Wirjatmadi (2005)
menambahkan bahwa kadar sianida dapat
dihilangkan dengan pencucian, perendaman,
perebusan dan penjemuran. Oleh sebab itu,
penurunan kandungan sianida pada produk
tepung
singkong
dikarenakan
terjadi
penguapan sianida bebas saat proses
pengeringan dengan menggunakan pengering
pada suhu 70OC
AGROINTEK Vol 4, No. 2 Agustus 2010
141
Kadar Sianida (ppm)
250.000
200.000
150.000
100.000
50.000
0.000
0
2
4
6
8
10
12
Maserasi (jam)
Gambar 1. Pengaruh Lama Maserasi terhadap
Kadar Sianida Pada Sampel singkong.
Karakterisasi Linamarase dari Singkong
pH Optimum
0.305
Aktivitas (unit)
0.285
0.265
0.245
0.225
0.205
0.185
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
pH
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap Aktivitas
Linamarase dari Singkong
Gambar 2 menunjukkan bahwa pH
berpengaruh terhadap aktivitas linamarse hasil
isolasi dari umbi singkong. Pada pH di bawah
6.0 menunjukkan bahwa aktivitas linamarase
lebih kecil. Hal itu disebabkan perubahan pH
mengakibatkan perubahan intramolekular
linamarase. Disamping itu, pH dibawah 6
diduga terjadi perubahan muatan listrik
substrat atau enzim, yaitu perubahan muatan
residu asam amino yang mengikat substrat
atau katalisis.
Whiteker
(1994)
menyebutkan
pengaruh pH terhadap katalitik enzim
terutama disebabkan oleh perubahan ionisasi
enzim pada gugus ionik pada sisi aktif atau
sisi yang lain yang secara tidak langsung
mempengaruhi sisi aktif. Gugus ionik
berperan dalam menjaga konformasi sisi aktif
dalam mengikat substrat menjadi produk.
pH optimum linamarase dari singkong
berkisar 6 dengan nilai aktivitas sebesar 0.287
unit. Pada pH 6 linamarase diduga
mempunyai stabilitas yang tinggi. Winarno
(1996) mengatakan enzim menunjukkan
aktivitas maksimum pada suatu kisaran pH
yang disebut pH optimum, dimana enzim
pada kondisi ini mempunyai stabilitas yang
tinggi. Karlson (1979) menambahkan bahwa
struktur ruang tiga dimensi yang stabil yang
oleh enzim pada kondisi pH
14 dimiliki
optimum.
Semakin jauh dari pH optimum
menunjukkan aktivitas linamarase hasil isolasi
dari umbi singkong semakin tidak stabil
sehingga aktivitasnya semakin rendah. Hal ini
karena enzim merupakan protein yang
tersusun atas asam-asam amino yang memiliki
kepekaan
terhadap
perubahan
pH
lingkungannya. Saat pH berada di atas pH
optimum, aktivitas linamarase mengalami
penurunan (Gambar 5.6). Menurut Muhtadi
(1992) mengatakan di luar kisaran pH
optimum enzim menjadi inaktif. Hal ini,
disebabkan perubahan pH mengakibatkan
perubahan intramolekuler dari enzim. Apabila
perubahan terlalu besar akan mengakibatkan
denaturasi enzim sehingga aktivitas enzim
akan hilang.
pH di atas pH optimum juga diduga
dapat menyebabkan denaturasi protein enzim
yang mengubah susunan ruang tiga demensi
molekul protein enzim. Menurut Naz (2002),
perubahan keaktifan enzim akibat perubahan
lingkungan
menyebabkan
terjadinya
perubahan ionisasi enzim. Wong (1995)
menambahkan, pH ekstrim berpengaruh
terhadap struktur enzim dan muatan substrat.
Kelebihan atau kekurangan ion H+
menyebabkan perubahan konformasi sisi aktif
enzim sehingga substrat tidak lagi berikatan
dengan enzim, selanjutnya berakibat pula
pada pembentukan produk. Poedjiadi (1994)
menambhakan pada pH tinggi selain
berpengaruh terhadap struktur ion pada enzim,
pH tinggi dapat pula menyebabkan denaturasi
yang mengakibatkan menurunnya aktivitas
enzim.
pH optimum aktivitas linanamarase
yang dihasilkan, sama dengan pH optimum
linamarase hasil isolasi dari Leuconostoc
Mesenteroides (Glieguen et al., 1997),
Linamarase hasil isolasi dari yest Endomyces
fibuliger (Brimer, et al., 1998) dan linamarase
hasil isolasi dari singkong (Ampe dan
Brauman, 1995) yaitu memiliki pH optimum
142
Isolasi dan Karakterisasi Linamarase...(Askurrahman)
6. Sedangkan hasil peneitian Mkpong (1990)
menyebutkan linamarase yang diisolasi dari
daun singkong mempunyai pH optimum 7 dan
linamarase yang diisolasi dari kacang koro
mempunyai pH optimum 5.6.
Suhu Optimum
0.290
Aktivitas (unit)
0.270
0.250
0.230
0.210
0.190
0.170
0.150
25
30
35
40
45
50
55
60
Suhu (OC)
Gambar 3. Pengaruh Suhu Terhadap Aktivitas
Linamarase dari Singkong
Gambar 3. menunjukkan bahwa suhu
berpengaruh terhadap aktivitas linarase hasil
isolasi dari umbi singkong. Pada suhu 3040OC menunjukkan peningkatan aktivitas
linamarase. Hal itu disebabkan karena
semakin meningkatnya suhu kecepatan reaksi
yang dikatalisis linamarase naik. Disamping
itu, kenaikan kecepatan dibawah suhu
optimum disebabkan oleh kenaikan energi
kinetika molekul-molekul yang bereaksi.
Kecepatan suatu reaksi enzimatis,
seperti kebanyakan reaksi kimia, meningkat
dengan naiknya suhu. Meningkatnya suhu
dapat mempengaruhi meningkatnya afinitas
enzim terhadap katalisator dan aktivator
sehingga mempercepat reaksi. Disamping itu,
peningkatan suhu akan menyebabkan
bertambahnya energi kinetik dari enzim
maupun substrat, sehingga akan terjadi
peningkatan kecepatan gerakan enzim dan
substrat, dan hal ini akan mengakibatkan
peningkatan peluang terjadinya tumbukan atar
keduanya. Makin besar frekuensi tumbukan
molekul enzim dengan substrat, maka makin
besar peluang terjadinya interaksi antara
enzim dengan substrat dan makin besar pula
peluang terbentuknya produk.
Pada suhu optimum dicapai aktivitas
enzim yang optimum dan dihasilkan produk
secara optimum pula. Menurut Robyt and
White (1987) kenaikan kecepatan dibawah
suhu optimum terjadi karena kenaikan energi
kinetik molekul-molekul yang bereaksi.
Menurut Arteaga and Nakai (1990),
pada suhu tinggi di atas suhu optimal akan
terjadi kerusakan protein yang disebut
denaturasi, sehingga terjadi penurunan
aktivitas.
Robyt
and
White
(1987)
menambahkan apabila suhu dinaikkan terusmenerus, energi kinetik kolekul enzim
menjadi besar sehingga mencapai energi
aktifasi untuk memecah ikatan sekunder dan
tersier yang mempertahankan enzim dalam
keadaan asli atau keadaan katalitik aktif
sehingga mengakibatkan hilangnya aktivitas
katalitik.
Pada suhu yang lebih tinggi dari pada
suhu optimum, aktivitas linamarase menurun.
Enzim dan substrat dapat mengalami
perubahan konformasi pada suhu yang terlalu
tinggi, sehingga gugus reaktif keduanya
menjadi tidak bersesuaian dan menyebabkan
tidak terjadi interaksi. Bila suhu terus
ditingkatkan maka enzim bisa terdenaturasi,
sehingga peluang terbentuknya produk
menurun. Menurut Siegel (1975) mengatakan
laju reaksi berkatalisis enzim akan meningkat
bila suhu dinaikkan, akan tetapi kenaikan ini
terbatas, oleh karena itu pada suhu tertentu
kenaikan itu akan mengakibatkan penurunan
aktivitas enzim yang disebabkan denaturasi
enzim. Whitaker (1994) menambhakan bahwa
perubahan suhu dapat mempengaruhi
konformasi enzim, karena terjadinya kenaikan
suhu menyebabkan peningkatan energi yang
akan mempengaruhi ikatan ion, hidrogen atau
interaksi hidrofobik yang berperan dalam
menjaga
konformasi
molekul
enzim.
Perubahan konformasi akan mempengaruhi
lokasi aktif dari enzim, akibatnya aktivitas
enzim menjadi berkurang (menurun).
Suhu optimum adalah 40OC dengan
jumlah aktivitas linamarase sebesar 0.271
unit. Sedangkan di atas dan di bawah 40OC
aktivitas linamarase mengalami penurunan.
Suhu optimum aktivitas linamarase hasil
isolasi dari umbi singkong adalah 40OC. Suhu
tersebut sama dengan suhu optimum aktivitas
linamarase
yang
diisolasi
dari
mikroorganisme Mucor cercirellodes LU M40
yaitu suhu 40OC (Petruccoli et al., 1999).
Sedangkan pada hasil penelitian Mkpong
(1990) mengatakan linamarase yang diisolasi
dari daun singkong memiliki suhu optimum
AGROINTEK Vol 4, No. 2 Agustus 2010
143
Waktu Inkubasi Optimum
Semakin lama waktu reaksi enzimatik
(pada waktu inkubasi 1-3 jam) maka semakin
tinggi aktivitas linamarase. Hal itu disebakan
karena terjadi pembentukan produk hasil
hidrolisis semakin meningkat.
Aktivitas (unit)
0.305
0.285
0.265
0.245
0.225
0.205
0.185
0.165
0.145
0.125
0
1
2
3
4
5
6
7
Waktu Inkubasi (jam)
Gambar 4. Pengaruh Waktu Inkubasi
Terhadap Aktivitas Linamarase dari Singkong
Pada reaksi enzimatik kurang dari
180 menit, aktivitas linamarase belum
maksimal. Hal itu diduga karena terlalu
singkatnya waktu yang berikatan antara
linamarase
dengan
substrat,
sehingga
produknya pula belum optimal pada saat
reaksi dihentikan.
Semakin
lama
waktu
reaksi
enzimatik maka semakin banyak produk yang
terbentuk, yang juga berarti aktivitas
linamarase
semakin
besar.
Aktivitas
linamarase terus meningkat hingga dicapai
waktu reaksi enzimatik optimum. Waktu
reaksi enzimatik optimum linamarase adalah
180 menit.
Setelah 180 menit, linamarase telah
jenuh berikatan dengan substrat, sehingga
pertambahan reaksi enzimatik tidak akan
menambah
pembentukan
produk
dan
akibatnya aktivitas linamarase menurun.
Penurunan nilai aktivitas enzim karena
melibatkan waktu inkubasi sebagai faktor
pembagi, sehingga bila faktor pembaginya
semakin besar, maka aktivitas yang dihasilkan
akan semakin kecil. Menurut Aulani’am
(2005), waktu yang digunakan enzim
berikatan dengan substrat secara tetap disebut
reaksi enzimatis. Dimana waktu reaksi
enzimatis sebanding dengan produk yang
dihasilkan.
Waktu inkubasi optimum adalah 180
menit
(3 jam) dengan jumlah aktivitas
linamarase sebesar 0.2791unit. Sedangkan di
atas dan di bawah waktu inkubasi 180 menit
(3 jam)
aktivitas linamarase mengalami
penurunan.
Pengaruh Konsentrasi Substrat
Kecepatan reaksi, akan meningkat
dengan meningkatnya konsetrasi substrat.
Akan tetapi penambahan substrat yang terusmenerus akan meningkatkan kecepatan reaksi
dengan laju yang semakin kecil. Pada
akhirnya akan tercapai titik batas dimana
kecepatan reaksi tidak lagi bertambah dengan
bertambahnya substrat. Kondisi seperti di atas
dapat terjadi dengan asumsi fakor-faktor lain
seperti suhu, pH dan lain-lain dalam keadaan
konstan. Menurut Reed (1966) mengatakan
kecepata reaksi enzimatis pada umumnya
tergantung pada konsentrasi substrat. Semakin
tinggi konsentrasi substrat, kecepatan
reaksinya semakin tinggi. Sampai batas
tertentu kecepatan reaksi akan konstan dengan
naiknya konsentrasi substrat (pada konsentrasi
enzim tetap).
Aktivitas (unit)
55OC dan linamarase yang diisolasi dari
kacang koro meliki suhu optimum 62OC.
0.300
0.290
0.280
0.270
0.260
0.250
0.240
0.230
0.220
0.210
0.200
0
3
6
9
12
15
18
21
Konsentrasi Substrat (%)
Gambar 5. Pengaruh Konsentrasi Substrat
Terhadap
Aktivitas
Linamarase
dari
Singkong.
Gambar 5. menunjukkan bahwa
semakin tinggi konsentrasi substrat maka
semakin tinggi pula aktivitas linamarase
sampai pada titik konstan. Meningkatnya
aktivitas linamarase ditunjukkan pada
konsentrasi 3% sampai 15%, sedangkan pada
konsentrasi 18% aktivitas linamarase terjadi
titik konstan. Konsnterasi substrat Optimum
yaitu pada konsentrasi 15% dengan aktivitas
0.286 unit.
144
Isolasi dan Karakterisasi Linamarase...(Askurrahman)
Whitaker (1994) mengatakan bahwa
semakin meningkatnya konsentrasi substrat
maka semakin menigkat pula aktivitas enzim
sampai pada titik konstan. Pada konsentrasi
substrat yang rendah, tidak semua molekulmolekul enzim akan berkombinasi dengan
substrat. Jika konsentrasi ditingkatkan,
molekul-molekul enzim akan lebih banyak
yang berkombinasi dengan substrat sampai
terjadi kondisi enzim jenuh dengan substrat.
Peningkatan konsentrasi substrat lebih lanjut
tidak akan meningkatkan laju reaksi.
Penentuan nilai Km dan Vmaks
linamarase dari umbi singkong diawali
dengan menghitung nilai Vo (kecepatan awal
linamarase
dalam
memecah
substrat
linamarin). Linamarase dari umbi singkong
diinkubasikan pada berbagai level konsentrasi
linamarin (3%, 6%, 9%, 12%, 15% dan 18%)
dengan pH 6, suhu 40OC selama 180 menit.
Nilai V awal dari masing-masing
konsentrasi substrat tersebut kemudian
diplotkan dalam bentuk kurva MichaelisMenten. Kurva Michaelis-Menten selanjutnya
dijadikan dasar untuk membentuk kurva
Lineweaver-Burk (Gambar 6)
untuk
memperoleh nilai Km dan Vmaks.
4.800
4.600
4.400
y = 0.0396x + 3.3811
1/Vo
4.200
2
R = 0.9043
4.000
3.800
3.600
3.400
3.200
-10.000
0.000
10.000
20.000
30.000
40.000
1/[S]
Gambar 6. Ploting Data Konsentrasi Substrat
dan Kecepatan Awal Reaksi dengan
Metode Lineweaver-Burk
Berdasarkan grafik hubungan antara
1/[S] dengan 1/Vo menurut metode
Lineweaver-Burk, maka Vmaks dan Km
enzim
dihitung
(Whittaker,
1994).
Berdasarkan perhitungan tersebut dapat
diketahui bahwa nilai Vmaks yang diperoleh
sebesar 0.296 Unit dan Km sebesar 0.012 %.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah
dilakukan, maka dapat ditarik kesimpulan
bahwa Kadar sianida pada umbi singkong
dengan perlakuan lama maserasi 8 jam adalah
sebesar 208.511 ppm dan Linamarase
memiliki kondisi optimum untuk aktivitasnya
sebagai berikut; pH sekitar 6, suhu sekitar
40OC, waktu Inkubasi sekitar 3 jam dan Km
sebesar 0.012% serta Vmaks sebesar 0.296
unit.
DAFTAR PUSTAKA
Anwar F. 2004. Beras Singkong Semi Instan.
Laboratorium Manajemen Pangan,
Fakultas Pertanian. IPB. Bogor.
Arteaga GE. and S. Nakai. 1990.
Tetrathionate
Protect
Proteolytic
Activity of Simultade Papaya Latex and
Crude Papain. J. Food Sci. 55(6): 17281734.
Aulanni’am. 2005. Protein dan Analisinya.
Citra Mentari Group. Malang
Brimer L, MJR. Nout and G. Tuncel. 1998. Glucosidase
(amygdalase
and
Linamarase) from Endomyces fibuliger
(LU677): formation and crude enzyme
properties.
J.
Appl
Microbiol
Biotechnol. 49:182-188
Chalil, D. 2003. Agribisnis Ubi Kayu di
Propinsi Sumatera Utara. Jurusan Sosial
Ekonomi Pertanian, Fakultas Pertanian,
Universitas Sumatera Utara. Medan.
Djazuli M. dan H. Bradbury. 1999. Cyanogen
Content of Cassava Roots and Flour In
Indonesia. Journal of Agricultural and
Food Chemistry. 65: 523-535.
Eksittikul T dan M. Chulavatnatol. 1988.
Characterization of Cyanogenic Glucosidase
(Linamarase)
from
Cassava (Manihot esculenta Crantz). J.
Archives
of
Biochemistry
and
Biophysics. 266 (1): 263-269.
Franzl S, I. Ackermann and A. Nasrstedt.
1989. Purification and Characterization
of a -glukosidase (Linamarase) from
the haemolymph of Zygaena trifolii
Esper, 1783 (Insecta, Lepidoptera).
Experintia, Birkhauser Verlag, CH4010 Basel/Switzerland.
Glieguen Y, P. Chemardin, P. Labrot, A.
Amaud and P. Galzy. 1997. Purification
and Characterization of an Intracellular
-Glucosidase from a New Strain of
AGROINTEK Vol 4, No. 2 Agustus 2010
Leuconostoc mesenteroides Isolated
from Cassava. Journal of Applied
Microbiology. 82:469-476.
Iglesias CA, T. Sanchez, and HH. Yeoh.
2002. Cyanogens and Linamarase
Activities in Storage Roots of Cassava
Plant from Breeding Program. Journal
of Food Composition and Analysis. 15:
3379-387.
Karlson P. 1979. Introduction to Modern
Biochemistry (Edisi ke-3), New York::
Academic Press.
Mkpong OE, H. Yan, G. Chism and R.T.
Sayre.
1990.
Purification,
Characterization, and Localization of
Linamarase in Cassava. J. Plant
Physiol. 93: 176-181
Muhtadi D. 1992. Enzim dalam Industri
Pangan dan Gizi. IPB. Bogor. Hal. 3137.
Nambisan B. 1999. Cassava Latex and Source
as Linamarase for Determination of
Linamarin. Journal of Agricultural and
Food Chemistry. 47: 372-373.
Naz S. 2002. Enzymes and Food. Oxford
University Press. Pakistan.
Pembayun R. 2000. Hydro Cyanic Acid and
Organoleptic Test on Gaddung Instant
Rice from Various Methods of
Detcsification. Proseding Seminar
Nasional Industri Pangan CO-13:97107.
Petruccioli M, L. Brimer, AR. Cicalini and F.
Federici. 1999. The Linamarase of
Mucor circinelloides LU M40 and its
Detoxifying Activity on Cassava. J.
App. Microbiology. 86: 302-310
Poedjiadi, 1994. Dasar-dasar Biokimia.
Jakarta: UI Press..
Reed RSD. 1966. Principles of Biochemistry.
Boston: Holgton Mifflin Co.
Robyt JF and BS. White. 1987. Biochemical
Technic Theory and Practical. New
York: Klower Academic Publisher.
Seidman L. and J. Mowery. 2006. Salting
Out: Ammonium Sulfate Precipitation.
The Biotechnology Project. Illinois
State University.
Siegel IH. 1975. Enzyme Kinetics Behavior
and Analysis of Rapid Equilibrium
Steady State Enzyme Sistems. New
York: John Willey and Sons.
145
Suryani CL. dan N. Westiani. 2000. Studi
Pembuatan Tepung Kara Benguk.
Prosiding Seminar Teknologi Pertanian
Spesifik
Lokasi
dalam
Upaya
Peningkatan Kesejahteraan Petani dan
Pelestarian Lingkungan. Yogyakarta.
Whitaker JR. 1994. Principle of Enzymology
for The Food Science. Second Edition.
New York :Marcel Decker.
Widyasaputra AF. 1992. Sifat Fisik dan Kimia
Tepung Ubi Jalar Kajian Suhu
Pemanasan dan Varietas. [Tesis yang
tidak dipublikasikan Program Studi
Ilmu Tanaman, Program Pasca Sarjana.
Unibraw. Malang]
Winarno FG. 1996. Enzim Pangan. Jakarta:
PT. Gramedia Pustaka Utama.
Wirjatmadi B. 2005. Pengaruh Beberapa
Perlakuan Terhadap Penurunan Kadar
HCN pada Ubi Kayu (Manihol
esculenta Crantz). Fakultas Kesehatan
Masyarakat. Universitas Airlangga.
Surabaya.
Wong DWS. 1995. Food Enzymes: Structure
and Mechanism. New York: Chapman
and Hall.
Yeoh HH and SV. Egan. 1997. An enzymebased Dip-stick for The estimation of
Cyanogenic Potential of Cassava Flour.
Food Chem. 60, 119-122.
Fly UP